DTP/ 293 El enjuague con solución salina promueve la cicatrización in vitro de heridas de fibroblastos gingivales humanos

Ir a: Abstracto Se cree que enjuagarse la boca con una solución de cloruro de sodio (NaCl) promueve la salud de las encías y mejora la cicatrización de las úlceras bucales. Sin embargo, se carece de evidencia científica que respalde esta suposición. Este estudio tiene como objetivo investigar el efecto y aclarar los mecanismos subyacentes del enjuague a corto plazo con NaCl sobre la cicatrización de heridas de fibroblastos gingivales humanos (hGF). Los hGF primarios aislados y los queratinocitos orales normales humanos (hNOK) se enjuagaron con NaCl al 0-7,2% durante 2 min, 3 veces al día. Se realizaron pruebas de rayado, ensayos de migración de pocillos trans y actividad MTT. Se evaluó la expresión de ARNm de colágeno de tipo I, fibronectina y FAK. Los cambios en FAK y F-actina se detectaron mediante inmunofluorescencia. KCl, NaH 2 PO 4 , KH 2 PO 4se utilizaron para aclarar las moléculas implicadas. El enjuague con NaCl al 0,9–1,8% promovió significativamente la migración de células de hGF, pero no la proliferación. Sin embargo, no tuvo ningún efecto sobre los hNOK. El enjuague con NaCl al 1,8% reguló significativamente la expresión de colágeno tipo I y fibronectina. FAK y F-actina, moléculas responsables de la reorganización del citoesqueleto y la migración celular, también fueron reguladas positivamente. Cl -parecía ser esencial ya que el enjuague con KCl resultó en un efecto similar al observado con NaCl. En conclusión, el enjuague a corto plazo con NaCl promovió la migración de hGF y aumentó la expresión de la matriz extracelular y de las proteínas del citoesqueleto. Estos datos apoyan firmemente la creencia arraigada en los beneficios del uso de enjuagues bucales con NaCl. Ir a: Introducción El tratamiento de la enfermedad de las encías con enjuagues salinos apareció en China ya en el 2700 aC [ 1, 2 ]. Durante mucho tiempo se ha creído que enjuagarse la boca con una solución de cloruro de sodio (NaCl) puede promover la salud de las encías y acelerar la cicatrización de las úlceras orales. Hoy en día, para mantener la salud bucal, muchos dentistas aconsejan a sus pacientes que se enjuaguen la boca con una solución salina como complemento del cuidado bucal de rutina. Sin embargo, hasta el momento, no existe evidencia científica que demuestre la eficacia de este sencillo método. Tampoco existe una concentración recomendada de NaCl que sea apropiada para el enjuague bucal sin causar daño tisular. Aún se desconoce el mecanismo detallado del efecto del NaCl sobre la cicatrización de heridas gingivales. Durante la cicatrización de heridas, la remodelación del tejido permite la sustitución del tejido lesionado. Se ha planteado la hipótesis de que los fibroblastos desempeñan un papel activo. Estas células se comprometen a repoblar los tejidos dañados a través de la proliferación, diferenciación y migración celular. Entre estos procesos, la migración celular es una respuesta biológica crítica durante la cicatrización de heridas [ 3 , 4 ]. La motilidad celular es estimulada por señales extracelulares, que luego inician proteínas de señalización intracelular que se localizan en los sitios de contacto con la matriz extracelular, denominados contactos focales. La quinasa de adhesión focal (FAK) es una proteína-tirosina quinasa intracelular que regula el ensamblaje y desensamblaje de los contactos focales necesarios para el movimiento eficiente de la célula [ 5 ]. La hiperosmolaridad es una condición por la cual la osmolalidad de la sangre en nuestro cuerpo es superior a 290 mOsmol / kg y la exposición de las células a una alta concentración de sal es un fenómeno común. En diferentes condiciones o con ciertos tipos de células, la hiperosmolaridad puede provocar daño o supervivencia celular [ 6 ]. Varios estudios demostraron que la exposición a un medio hiperosmótico apropiado puede aumentar el diámetro celular y el área de adhesión de los fibroblastos y mioblastos [ 7 , 8]. En comparación con los fibroblastos cutáneos, los fibroblastos gingivales expresan un fenotipo específico en el que las moléculas implicadas en la regulación de la inflamación y la remodelación de la matriz extracelular se encuentran elevadas [ 9 , 10]. Estas diferencias inherentes del fenotipo de fibroblasto gingival pueden ser la base de la capacidad de las heridas gingivales de curar más rápido con menos formación de cicatrices en comparación con las heridas cutáneas. Aún no hay datos disponibles sobre la respuesta del fibroblasto gingival a una condición de hiperosmolaridad. Para investigar el efecto del enjuague repetido a corto plazo con solución de NaCl sobre el comportamiento de los fibroblastos gingivales humanos (hGF), planteamos la hipótesis de que el NaCl puede estimular la migración de hGF primarios y, por lo tanto, la cicatrización de heridas in vitro . La migración se analizará en dos sistemas, el ensayo de raspado y un sistema transpocillo. Además, también se aclararán algunos de los mecanismos subyacentes al efecto del NaCl sobre el comportamiento de los fibroblastos gingivales. Ir a: Materiales y métodos Cultivo de células Los terceros molares de voluntarios jóvenes sanos, de 18 a 25 años de edad, fueron extraídos según lo recomendado por su dentista. Inmediatamente después de la extracción, los dientes se transfirieron al laboratorio en un medio de almacenamiento helado DMEM (# 11960, Gibco, Life Technologies Corporation, Grand Island, NY) suplementado con 10% FBS, 1% L-Gluamine, 0,5 mg / ml gentamicina y 3 mg / ml de anfotericina B. Los tejidos gingivales adheridos al área cervical se retiraron cuidadosamente del diente y se enjuagaron dos veces con PBS. El tejido se trituró en trozos de 1x2 mm con una cuchilla quirúrgica y se sembró en DMEM suplementado con FBS al 10%, L-Gluamina al 1%, antibióticos al 1%. Las muestras de tejido se incubaron a 37 ° C humidificado atmósfera con 5% de CO 2 , el medio se sustituyó cada 3 días hasta que las células alcanzaron la confluencia outgrowing. Los hGF primarios en el 3rd- 6 th pasaje se utilizaron para los experimentos. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de tejidos desechados con fines de investigación. Las muestras de tejido fueron desidentificadas y analizadas de forma anónima. El Comité de Ética de la Facultad de Odontología de la Universidad de Chulalongkorn, Tailandia, aprobó que el estudio se lleve a cabo de acuerdo con el protocolo y el permiso informado fechado y / o modificado de la siguiente manera de conformidad con la ICH / GCP (HREC-DCU 2015–068) . Se cultivaron queratinocitos orales humanos normales (hNOK) en medio sin suero de queratinocitos (n.º 17005-042, Gibco) complementado con extracto de pituitaria bovina (BPE) y factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (rEGF) (n.º 13028-014, n.º 10450– 013, Gibco) como estudio previo [ 11]. El medio se cambió cada 5 días hasta una confluencia del 70% para experimentos adicionales. Ensayo de prueba de rayado ("ensayo de cicatrización de heridas") Para evaluar el efecto de NaCl sobre la migración de hGF y hNOK, se realizó el ensayo de prueba de raspado. Las células se sembraron en 24 pocillos de placas (39.500 células / cm 2 ). Después de 24 h, se utilizó una punta de pipeta estéril de 200 μl para trazar una línea recta en la monocapa de células confluentes en la parte inferior de la placa de cultivo (simulando una herida). Los restos se lavaron con PBS y luego las células se cultivaron a 37 ° C, se humedecieron con CO 2 al 5% .. Las células se enjuagaron con NaCl al 0, 0,9%, 1,8%, 3,6% o 7,2% en medio de cultivo durante 2 minutos, 3 veces al día durante 48 h (cada 5-6 horas). En los puntos de tiempo 0, 24 y 48 h, las áreas de "herida" se observaron y registraron mediante un microscopio invertido y una cámara digital en la misma posición de la placa de cultivo. El área de "cicatrización de heridas" se analizó utilizando el software Image-Analysis J 1.45S (Wayne Rasband, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD) como se describió anteriormente [ 12 ]. Se compararon las áreas de "heridas" restantes entre los grupos. Con el mismo protocolo 2,9% KCl, 10% NaH 2 PO 4 , 9,7% KH 2 PO 4se utilizaron para dilucidar las moléculas candidatas que ejercían el efecto sobre la migración (las concentraciones se calcularon para ser equivalentes en molaridad a NaCl, Na +0,121 M y Cl - 0,187 M ). Ensayo de proliferación celular La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT, n.º 298-931, USB Corporation, Cleveland, OH). Las células se sembraron a 2x10 4 células / cm 2 en placa de 24 pocillos. Después de 24 h, el medio se cambió a medio sin suero durante 4 horas y luego las células no raspadas se enjuagaron con NaCl al 0,9%, 1,8%, 3,6%, 7,2% o NaCl al 1,8%, KCl al 2,9%, NaH 2 PO al 10% 4 , 9,7% KH 2 PO 4en medio de cultivo durante 2 minutos, 3 veces al día. El grupo de control (sin tratar) se enjuagó con medio de crecimiento normal. Después de 48 h, el medio se reemplazó con 0,5 ml de solución de MTT y se incubó durante 30 min a 37 ° C. El producto de formazán se disolvió en una solución de solubilización / parada. Utilizando un lector de microplacas (ELx800, BioTek, Winooski, VT), se midieron las densidades ópticas a 570 nm. La diferencia de absorbancia entre los grupos presentó la variedad de números de células. Ensayo de migración Transwell El ensayo de migración celular se realizó en insertos Transwell de 24 pocillos con membrana de policarbonato de poro de 8,0 μm y un área de crecimiento efectiva de 0,3 cm 2 (n. ° 3422, insertos de cultivo celular BD FalconTM, BD Biosciences, Bedford, MA). Los hGF se tripsinizaron y se resuspendieron en medio sin suero. En cada inserto se sembraron 1 x 105 células en un total de 200 µl de medio. Una hora después de la siembra, se inició el protocolo de enjuague. Brevemente, los insertos se movieron a nuevas placas de 24 pocillos que contienen 700 μl de 0, 0,9, 1,8, 3,6 o 7,2% de NaCl o 1,8% de NaCl, 2,9% de KCl, 10% de NaH 2 PO 4 , 9,7% de KH 2 PO 4en medio sin suero durante 2 minutos, 3 veces al día. Para prevenir la proliferación celular, el ensayo de migración se realizó con medio sin suero durante solo 24 horas. Al día siguiente, las células no migradas de la superficie superior de la membrana se eliminaron cuidadosamente con un hisopo de algodón. Las células que migraron al otro lado de la membrana se fijaron en metanol frío durante 10 minutos, se tiñeron con violeta cristal al 1,4% y se lavaron tres veces con agua destilada. La migración celular se evaluó mediante microfotografías de cinco campos elegidos al azar (x100) por inserto para contar el número de células migradas y el área de adhesión utilizando el software Image-Analysis J 1.45S como se describió anteriormente [ 13 ]. Se compararon el número de células migradas y el área de células por célula entre grupos. Análisis de ARN por transcripción inversa semicuantitativa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) Para realizar RT-PCR semicuantitativa, después de enjuagar con NaCl al 1,8%, KCl al 2,9%, NaH 2 PO 4 al10% , KH 2 PO 4 al 9,7% en medio de cultivo durante 2 minutos, 3 veces al día, se obtuvo el ARNm total de hGF aislado usando reactivo Trizol (# 2302700, Prime, Gaithersburg, MD). El ADNc de primera hebra se sintetizó usando la reacción de transcriptasa inversa mediante el sistema de transcripción inversa ImProm-II (nº A3800, Promega Corporation, Madison, WI) y se realizó una PCR semicuantitativa siguiendo el manual del fabricante. Se utilizó un cebador de PCR para colágeno tipo I (COL1), fibronectina (Fn) y quinasa de adhesión focal (FAK) para cribar la expresión génica de la matriz extracelular (tabla 1). Todas las bandas se escanearon, analizaron y normalizaron con la expresión del gen de mantenimiento gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) utilizando el software Bio-1D versión 15.03 (Vilber Lourmat, Marne La Vallée, Francia). Se repitieron tres experimentos independientes en cada muestra para comparar el cambio de veces de la expresión génica. Fuente y Artículo completo: Biblioteca de Medicina de EEUU https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4956236/?_ga=2.238914624.1180966717.1637858719-1018256504.1637858719